脊椎動(dòng)物可以產(chǎn)生抗體的B淋巴細(xì)胞首先作為造血干細(xì)胞出現(xiàn)在骨髓中，并分化為祖B細(xì)胞（pro-B）、前B細(xì)胞（pre-B）和未成熟的B淋巴細(xì)胞。未成熟的B淋巴細(xì)胞表面帶有可特異性結(jié)合抗原的免疫球蛋白受體。在離開(kāi)骨髓之前，未成熟的B淋巴細(xì)胞上的IgM型抗原特異性受體可用于去除與自身抗原發(fā)生反應(yīng)的淋巴細(xì)胞。這個(gè)過(guò)程對(duì)自身抗原的攻擊極為重要。只有對(duì)自身抗原不敏感的未成熟B淋巴細(xì)胞能夠分化為成熟的B淋巴細(xì)胞，表達(dá)IgM型和IgD型免疫球蛋白。這一過(guò)程主要發(fā)生在骨髓中，脾臟和淋巴結(jié)等次級(jí)淋巴器官也有發(fā)生。當(dāng)免疫細(xì)胞遇到外來(lái)抗原時(shí)，免疫反應(yīng)迅速產(chǎn)生。首先，專(zhuān)業(yè)的抗原遞呈細(xì)胞捕獲入侵的外來(lái)抗原，并與MHC Ⅱ類(lèi)分子在細(xì)胞表面結(jié)合以呈遞免疫信息。然后，這些信息被傳遞至輔助性T淋巴細(xì)胞，輔助性T淋巴細(xì)胞被激活后選擇性刺激抗原敏感的成熟B淋巴細(xì)胞，這些B淋巴細(xì)胞在其細(xì)胞表面可與同樣的MHC復(fù)合物結(jié)合，這一現(xiàn)象也發(fā)生在抗原激活的專(zhuān)業(yè)抗原遞呈細(xì)胞上。抗原激活后的第二個(gè)主要過(guò)程是變?yōu)橛洃汢淋巴細(xì)胞，記憶B淋巴細(xì)胞可以被同一抗原再次快速激活。記憶B淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生與類(lèi)別轉(zhuǎn)換和體細(xì)胞超突變有關(guān)。同一抗原的重復(fù)刺激有助于高親和力抗體的產(chǎn)生，這一過(guò)程被稱(chēng)為親和力成熟。

        原始的雜交瘤技術(shù)利用日本血凝病毒（HVJ）和聚乙二醇（PEG）融合抗原致敏的B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞從而產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞，存在大量不可控的非特異性融合。產(chǎn)生高親和力和高特異性單克隆抗體的雜交瘤技術(shù)有兩個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)。第一點(diǎn)是B淋巴細(xì)胞分化成熟的免疫過(guò)程。第二點(diǎn)是靶向抗原致敏的B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的選擇性融合過(guò)程。

這篇文章介紹了基于抗原對(duì)B淋巴細(xì)胞預(yù)選的新一代雜交瘤技術(shù)，并使用電脈沖將其與骨髓瘤細(xì)胞選擇性融合。

1.傳統(tǒng)雜交瘤技術(shù)

       在雜交瘤技術(shù)出現(xiàn)之前，抗體主要來(lái)自免疫動(dòng)物血清的多克隆抗體，這些抗體具有不均質(zhì)性，可與幾種表位交叉反應(yīng)。使用HVJ或PEG的傳統(tǒng)雜交瘤技術(shù)可產(chǎn)生具有均質(zhì)性的單克隆抗體，特異性識(shí)別單一的抗原表位，融合效率較低。

圖1：基于PEG和HVJ的傳統(tǒng)雜交瘤技術(shù)。B：B淋巴細(xì)胞；M：骨髓瘤細(xì)胞；BM:雜交瘤細(xì)胞。

2，改良的雜交瘤技術(shù)

        為了改良傳統(tǒng)雜交瘤技術(shù)，新的雜交瘤技術(shù)陸續(xù)被建立。珍珠鏈形式通過(guò)施加不均勻的交流電場(chǎng)，骨髓瘤細(xì)胞和免疫的B淋巴細(xì)胞在電極表面形成單層，并在電場(chǎng)脈沖下融合形成雜交瘤細(xì)胞。這一方法提高了融合效率，但仍舊存在脾細(xì)胞-脾細(xì)胞融合和瘤細(xì)胞-瘤細(xì)胞融合。此外，也無(wú)法控制所融合的B淋巴細(xì)胞是否具有特異性。

圖2：基于珍珠鏈形式的改良雜交瘤技術(shù)

如圖三所示的激光輻射模式，在顯微鏡下，捕獲激光轉(zhuǎn)移淋巴細(xì)胞使其與骨髓瘤細(xì)胞接觸，接著用脈沖激光束照射淋巴細(xì)胞-骨髓瘤細(xì)胞的接觸表面。這一手動(dòng)操過(guò)程可以準(zhǔn)確的控制淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞之間的融合。但是耗時(shí)，也無(wú)法確定與骨髓瘤細(xì)胞融合的B淋巴細(xì)胞是否具有特異性。

圖3：基于激光輻射的改良雜交瘤技術(shù)

3.新一代雜交瘤技術(shù)-靶向B細(xì)胞

       為了實(shí)現(xiàn)特異性B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞選擇性融合，建立了脈沖電場(chǎng)法或B細(xì)胞靶向技術(shù)（BCT）。這一技術(shù)包括三個(gè)關(guān)鍵步驟。首先是利用免疫球蛋白受體對(duì)抗原致敏B淋巴細(xì)胞的預(yù)選。其次是通過(guò)生物素和親和素使抗原選擇的B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞接觸。最后是B淋巴細(xì)胞-骨髓瘤細(xì)胞通過(guò)電脈沖選擇性融合。根據(jù)選擇B淋巴細(xì)胞的結(jié)合物，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了兩種BCT方案，即抗原-生物素（FIG4A）或抗原-親和素（FIG4B）。后一種情況也可使用抗原-鏈霉親合素。

圖4：基于BCT的新一代雜交瘤技術(shù)。Ag:抗原；Av：親和素；B：B淋巴細(xì)胞；M:骨髓瘤細(xì)胞；BM:雜交瘤細(xì)胞；NHS-Bio：羥基琥珀酰亞胺-生物素；StAv：鏈霉親合素。

      第一種方案中，抗原選擇的B淋巴細(xì)胞可以通過(guò)親和素或鏈霉親合素形成B細(xì)胞-抗原-生物素-親和素（鏈霉親合素）-B細(xì)胞復(fù)合物?？乖?生物素結(jié)合物選擇B淋巴細(xì)胞后，由于添加親和素或鏈霉親合素會(huì)形成B細(xì)胞-B細(xì)胞復(fù)合物，可能會(huì)導(dǎo)致抗原選擇的B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞之間融合效率降低，但可以通過(guò)在生物素化抗原中加入過(guò)量的親和素或鏈霉親合素來(lái)改善。

    當(dāng)使用來(lái)自牛心臟線(xiàn)粒體的F₀F₁-ATPase的F₀亞基作為抗原時(shí)，融合效率超過(guò)16.5%，而通過(guò)PEG介導(dǎo)的方法融合效率僅為1.1-5.6%。并且，鏈霉親合素具有酸性等電點(diǎn)（pI）,在中性pH條件下帶有負(fù)電荷，因而可抑制鏈霉親合素與帶負(fù)電的B淋巴細(xì)胞的非特異性結(jié)合。

       為了防止形成B細(xì)胞-B細(xì)胞復(fù)合物，可以使用第二種方案中的抗原-親和素（或抗原-鏈霉親合素）復(fù)合物來(lái)選擇B淋巴細(xì)胞。通過(guò)抗原-生物素或抗原-親和素（或抗原-鏈霉親合素）復(fù)合物預(yù)選得到來(lái)自抗原免疫小鼠的B淋巴細(xì)胞后，利用生物素和親和素（或鏈霉親合素）使之與骨髓瘤細(xì)胞連接。

4.BCT的應(yīng)用

          根據(jù)圖4B，首先使用由49個(gè)氨基酸組成的，包含三個(gè)不同的目標(biāo)肽序列長(zhǎng)肽進(jìn)行免疫，然后將三種不同的肽-親和素復(fù)合物用于預(yù)選B淋巴細(xì)胞。結(jié)果，以平均50.4%的高融合率成功產(chǎn)生了單克隆抗體。這是用PEG介導(dǎo)方法獲得結(jié)果的5-40倍（僅1.8-8.2%）。此外，由BCT產(chǎn)生的每種單克隆抗體對(duì)相應(yīng)的肽序列顯示出高特異性。在長(zhǎng)肽中未檢測(cè)到與其他肽序列的交叉反應(yīng)。PEG方法生成的單克隆抗體沒(méi)有特異性反應(yīng)，但顯示出與未指定區(qū)域的交叉反應(yīng)性，與BCT方法形成鮮明對(duì)比。接著，還證實(shí)了BCT對(duì)于15個(gè)氨基酸組成的短肽序列的適用性，成功獲得基于BCT產(chǎn)生針對(duì)短肽序列的特異性單克隆抗體。

為了測(cè)試BCT對(duì)低分子量化合物的潛力，選擇鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）作為抗原。成功的產(chǎn)生針對(duì)DEHP的新型高親和力單克隆抗體，該抗體與其他鄰苯二甲酸酯衍生物幾乎沒(méi)有交叉反應(yīng)?？寺‰s交瘤細(xì)胞后，解離常數(shù)（Kd）值介于10^-9和10^-11之間。

因此，BCT可用于有效產(chǎn)生針對(duì)肽和低分子量化合物的單克隆抗體。從理論上說(shuō)，BCT產(chǎn)生的所有雜交瘤細(xì)胞都可以分泌所需的單克隆抗體。

5.體外免疫

      免疫通常必須在體內(nèi)進(jìn)行，并且需要幾個(gè)月的時(shí)間才能完成。如果免疫可以在短期內(nèi)完成，那肯定會(huì)促進(jìn)單克隆抗體的迅速產(chǎn)生。因此本文提出體外免疫，將未免疫小鼠的脾細(xì)胞與胞壁酰二肽、IL-4、脂多糖和靶標(biāo)抗原于37℃在CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5天。免疫熒光分析即可檢測(cè)到一些抗原選擇的B淋巴細(xì)胞，并且通過(guò)熒光激活細(xì)胞分選分析還發(fā)現(xiàn)了IgM和IgD雙陽(yáng)性成熟B淋巴細(xì)胞。然而，BCT體外免疫后產(chǎn)生的單克隆抗體表現(xiàn)出相對(duì)較寬的交叉反應(yīng)性。

6.多靶標(biāo)技術(shù)

傳統(tǒng)方法中一只小鼠產(chǎn)生針對(duì)一種抗原的單克隆抗體。如果僅使用一只小鼠產(chǎn)生針對(duì)多種抗原的單克隆抗體，將有助于小鼠的保護(hù)并減少產(chǎn)生單克隆抗體的工作量。為了實(shí)現(xiàn)此目標(biāo)，開(kāi)發(fā)了一種多靶標(biāo)技術(shù)，使用對(duì)應(yīng)的抗原，基于B淋巴細(xì)胞上的免疫球蛋白受體，將被多種抗原致敏的B淋巴細(xì)胞預(yù)選出來(lái)。初步結(jié)果表明，在用多種抗原免疫后，在多種致敏B淋巴細(xì)胞存在的情況下，用對(duì)應(yīng)抗原進(jìn)行特異性B淋巴細(xì)胞選擇時(shí)，目標(biāo)抗原可以特異性地選擇每個(gè)B淋巴細(xì)胞。將多種抗原用于一只小鼠的免疫時(shí)，由于其他抗原的免疫刺激會(huì)發(fā)生免疫抑制，因此一只小鼠僅可使用3-5個(gè)抗原進(jìn)行免疫。

圖5：基于多靶標(biāo)技術(shù)的新一代雜交瘤技術(shù)

7.立體特異性靶向技術(shù)

立體特異性靶向技術(shù)針對(duì)抗原三級(jí)結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生特異性單克隆抗體。使用表達(dá)抗原的骨髓瘤細(xì)胞來(lái)選擇致敏B淋巴細(xì)胞，完整的細(xì)胞表面表達(dá)的抗原保留其三級(jí)結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)染后的骨髓瘤細(xì)胞保持高存活力。骨髓瘤細(xì)胞-（抗原）-（免疫球蛋白受體）-B淋巴細(xì)胞復(fù)合物，通過(guò)電脈沖選擇性融合。PEG也可使骨髓瘤細(xì)胞選擇的B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞特異性融合。當(dāng)選擇促甲狀腺激素受體作為抗原時(shí)，針對(duì)促甲狀腺激素受體的單克隆抗體能夠競(jìng)爭(zhēng)TSH上相同的結(jié)合位點(diǎn)。立體特異性靶向技術(shù)所產(chǎn)生的的雜交瘤細(xì)胞效率低于通過(guò)BCT獲得的。

圖6：基于立體特異性靶向技術(shù)的新一代雜交瘤技術(shù)

醫(yī)用人單克隆抗體對(duì)靶抗原具有非常高的特異性，具有相對(duì)較長(zhǎng)的半衰期，同時(shí)對(duì)人體產(chǎn)生的副作用較小,因而需求已急劇增加。立體特異性靶向技術(shù)可產(chǎn)生針對(duì)所需抗原三級(jí)結(jié)構(gòu)的特異性單克隆抗體。立體特異性靶向和轉(zhuǎn)基因小鼠的組合對(duì)于產(chǎn)生針對(duì)靶抗原的構(gòu)象特異性人單克隆抗體是明確可行的。

BCT技術(shù)、多靶標(biāo)技術(shù)和立體特異性靶向技術(shù)中最重要的一步就是將抗原選擇的B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞選擇性融合。施加電脈沖時(shí)，在平行排列的電極之間會(huì)形成垂直強(qiáng)電場(chǎng)。沿電場(chǎng)排列的B淋巴細(xì)胞-骨髓瘤復(fù)合物可以有效融合，而在任何其他方向上的復(fù)合物都不會(huì)發(fā)生電融合。目前還沒(méi)有關(guān)于細(xì)胞復(fù)合物角度的電融合效率的研究。但通過(guò)控制其方向排列，效率可以顯著提高。激光，電泳，磁力和微流控，介電電泳作為驅(qū)動(dòng)力可操縱細(xì)胞的排列結(jié)構(gòu)。因此，在施加電場(chǎng)以進(jìn)行細(xì)胞融合之前使用介電電泳技術(shù)可能會(huì)顯著提高效率。另外，由于介電電泳操縱是基于交流電壓，因此可以很容易融合到細(xì)胞系統(tǒng)中。

體外免疫可以使用較低水平的、體內(nèi)有毒或不穩(wěn)定的抗原，且該過(guò)程可在3-5天內(nèi)完成。但由于免疫時(shí)間較短，B淋巴細(xì)胞的成熟程度可能不足。轉(zhuǎn)基因Immorto小鼠細(xì)胞在體外的壽命較長(zhǎng)，可以解決這一問(wèn)題。

除小鼠外，還可使用其他動(dòng)物物種利用雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生單克隆抗體。兔子等較大的動(dòng)物可能具有更大的B淋巴細(xì)胞庫(kù)。免疫的兔脾細(xì)胞與含有兔轉(zhuǎn)基因的小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合時(shí)，生成的異種雜交瘤細(xì)胞非常不穩(wěn)定。因此在降解之前，從異種雜交瘤細(xì)胞中分離編碼目標(biāo)抗體的基因并轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物，以產(chǎn)生Kd值約為10^-14M，具極高親和力的單克隆抗體。

Masahiro Tomita, Kanta Tsumoto. Hybridoma technologies for antibody production. Immunotherapy(2011)3(3).371-380.