一、前言
在生命科學(xué)中，在許多情況下，及時(shí)且經(jīng)濟(jì)高效地檢測(cè)和定量樣品中的抗原或抗體非常重要。從識(shí)別接種疫苗或感染個(gè)體的免疫反應(yīng)，檢測(cè)您希望在細(xì)胞表面表達(dá)的蛋白質(zhì)的表達(dá)，到進(jìn)行質(zhì)量控制測(cè)試。擁有能夠進(jìn)行此類評(píng)估的工具是關(guān)鍵。
酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定 （ELISA） 就是這樣一種測(cè)試，已被證明作為一種研究和診斷工具非常寶貴。在本文中，我們將考慮什么是 ELISA、它是如何工作的、技術(shù)的變化以及它可以告訴您什么。
二、什么是ELISA？
ELISA是一種免疫學(xué)檢測(cè)方法，通常用于測(cè)量生物樣品中的抗體或抗原，包括蛋白質(zhì)或糖蛋白。與其他免疫測(cè)定一樣，它們依賴于抗體與靶標(biāo)的結(jié)合來(lái)促進(jìn)檢測(cè)。
通常，ELISA檢測(cè)在96孔板中進(jìn)行，這種形式使其適合一次篩選多個(gè)樣品。血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清液、細(xì)胞裂解物、唾液、組織裂解物和尿液都是用于這些分析的常見(jiàn)樣品類型，但理論上可以使用大多數(shù)液體樣品類型。然而，重要的是要考慮到某些樣品類型可能包含抑制因子，例如具有相似抗原表位的緩沖液成分或蛋白酶等因子這可能會(huì)損壞靶標(biāo)或檢測(cè)組分，從而干擾檢測(cè)的性能。
有幾種不同的檢測(cè)形式，但都依賴于靶標(biāo)本身的結(jié)合或能夠?qū)袠?biāo)捕獲到板表面的抗體/抗原的結(jié)合。然后采用涉及偶聯(lián)抗原或更常見(jiàn)的抗體的檢測(cè)步驟來(lái)檢測(cè)和定量成功結(jié)合，最常見(jiàn)的是通過(guò)比色檢測(cè)。
三、ELISA的類型和檢測(cè)圖
ELISA 最初是由瑞典斯德哥爾摩大學(xué)的Eva Engvall和Peter Perlman以及荷蘭的Anton Schuurs和Bauke van Weemen于1971年互相獨(dú)立發(fā)明的。他們尋求一種能夠檢測(cè)抗原或抗體存在的免疫測(cè)定方法來(lái)取代放射免疫測(cè)定，后者使用具有潛在危險(xiǎn)的放射性標(biāo)記抗原或抗體，從而設(shè)計(jì)了一種基于酶的替代方案。
現(xiàn)在有四種主要類型的ELISA，直接、間接、夾心和競(jìng)爭(zhēng)。
下圖說(shuō)明了抗原的檢測(cè)；然而，相同的原理基本上適用于抗體檢測(cè)，抗原和一抗的作用是相反的。
ELISA 的類型
通過(guò)直接ELISA，樣品中的抗原或抗體以非特異性方式直接吸附到檢測(cè)板上。然后將對(duì)靶標(biāo)具有特異性的偶聯(lián)檢測(cè)抗體或抗原應(yīng)用于孔中。在此之后，使用檢測(cè)底物產(chǎn)生可測(cè)量的顏色變化，該變化可以在讀板器中量化。
由于該檢測(cè)步驟少，因此與其他ELISA方法相比，它更快且引入錯(cuò)誤的機(jī)會(huì)更少。但是，由于吸附步驟是非特異性的，因此背景噪聲可能很高。沒(méi)有二抗步驟意味著沒(méi)有信號(hào)放大，從而降低了檢測(cè)靈敏度。它還需要為每個(gè)所需的靶標(biāo)創(chuàng)建偶聯(lián)檢測(cè)抗體/抗原。
直接ELISA
最初開(kāi)發(fā)于1978年對(duì)于人血清白蛋白的檢測(cè)，間接ELISA或iELISA的工作原理與直接ELISA 非常相似，只是增加了二抗步驟。這使得測(cè)試信號(hào)的放大成為可能，克服了直接ELISA的限制。它還消除了對(duì)靶標(biāo)特異性偶聯(lián)檢測(cè)抗體/抗原的需求，因?yàn)榕悸?lián)的二抗只需要對(duì)一抗具有物種特異性。當(dāng)總樣品抗原結(jié)合到板上時(shí)，如直接ELISA，背景噪聲仍然是一個(gè)問(wèn)題。但是，如果該檢測(cè)用于檢測(cè)樣品抗體，則純化的靶抗原被包被到板上，一抗來(lái)自樣品。這大大降低了背景噪音，因此這些分析法在測(cè)定樣品中的抗體滴度方面最受歡迎。
間接 ELISA 的缺點(diǎn)包括方案較長(zhǎng)，出錯(cuò)的機(jī)會(huì)更多，并且可能與二抗發(fā)生交叉反應(yīng)。
開(kāi)發(fā)于1977年，顧名思義，夾心ELISA將抗原夾在抗體之間。該技術(shù)可以采用直接或間接 ELISA形式（上面描述的夾心ELISA基于間接ELISA），不同之處在于捕獲抗體不是抗原與檢測(cè)板的非特異性結(jié)合，而是使其成為一個(gè)特異性過(guò)程。這種組合進(jìn)一步提高了檢測(cè)的靈敏度和特異性。
然而，它們確實(shí)需要確定相容的捕獲和檢測(cè)抗體對(duì)才能有效發(fā)揮作用，而交叉反應(yīng)性可能會(huì)有問(wèn)題。這種分析通常也具有最多的步驟，因此出錯(cuò)的機(jī)會(huì)更大。由于抗原結(jié)合步驟的選擇性，夾心ELISA在抗原處于復(fù)合物混合物中時(shí)特別有用，因?yàn)椴恍枰乖兓?br />
夾心ELISA
競(jìng)爭(zhēng)性ELISA，也稱為抑制ELISA或封閉ELISA，可能是最復(fù)雜的ELISA技術(shù)。最初開(kāi)發(fā)于 1976年對(duì)于人絨毛膜促性腺激素的檢測(cè)，該檢測(cè)通過(guò)檢測(cè)對(duì)預(yù)期輸出信號(hào)水平的干擾來(lái)工作，從而產(chǎn)生反比關(guān)系。所施加的樣品中的靶標(biāo)越多，檢測(cè)輸出信號(hào)就越低。有多種形式可供選擇，其他ELISA類型可以適應(yīng)競(jìng)爭(zhēng)形式。但是，有兩個(gè)一般原則；樣品抗原或抗體與參比分別與有限量的標(biāo)記抗體或抗原結(jié)合。或者，樣品抗原或抗體可能與標(biāo)記的參考物質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)，分別與有限量的抗體或抗原結(jié)合。
競(jìng)爭(zhēng)性ELISA將具有與其改編形式相同的一些優(yōu)勢(shì)和局限性。然而，當(dāng)抗原較小時(shí)，它會(huì)有所幫助，如限制兩種抗體同時(shí)結(jié)合的能力（如夾心ELISA的要求），或者當(dāng)只有一種抗體可用時(shí)。
競(jìng)爭(zhēng)ELISA
四、ELISA步驟
雖然不同類型ELISA的實(shí)驗(yàn)方案存在差異，但應(yīng)考慮大多數(shù)檢測(cè)的共同階段。
大多數(shù)ELISA的第一步是將檢測(cè)的第一組分與檢測(cè)板結(jié)合。這通常是通過(guò)被動(dòng)吸附完成的，這是一個(gè)非特異性過(guò)程，因此結(jié)果將取決于應(yīng)用于板的物質(zhì)。如果應(yīng)用含抗原的樣品，則結(jié)果是板仍然需要選擇性步驟，因?yàn)楦鞣N抗原都會(huì)結(jié)合，而不僅僅是感興趣的抗原。但是，如果應(yīng)用純化的抗原（如用于抗體檢測(cè)的間接ELISA）或捕獲抗體（如夾心ELISA的情況 ），則可直接包被。
根據(jù)檢測(cè)的靶標(biāo)和性質(zhì)，可以使用多種板類型，其中大多數(shù)是聚苯乙烯或聚苯乙烯衍生物，具有不同的結(jié)合特性。一些靶標(biāo)，包括高度糖基化的蛋白質(zhì)、碳水化合物、DNA、脂質(zhì)、短肽和去污劑存在下的蛋白質(zhì)，不能很好地吸附。在這些情況下，建議使用經(jīng)過(guò)處理以允許與表面共結(jié)合的板。
向ELISA板中添加試劑后，必須對(duì)其進(jìn)行孵育，以便進(jìn)行結(jié)合或反應(yīng)。每次孵育的溫度和持續(xù)時(shí)間將取決于檢測(cè)步驟和所執(zhí)行的操作。通常在37 °C下孵育1~2小時(shí)或4℃過(guò)夜。
洗板是每一個(gè)步驟留下預(yù)期待測(cè)物或抗體的重要步驟。從孔中清空溶液后，用緩沖液（通常是磷酸鹽緩沖鹽水-吐溫20 （PBST））洗滌孔，以去除殘留的任何未結(jié)合抗原、抗體或試劑。這可以使用多通道移液器或使用自動(dòng)洗板機(jī)完成。洗滌不充分可能會(huì)導(dǎo)致背景信號(hào)高，而洗滌過(guò)多會(huì)導(dǎo)致樣品信號(hào)低。不一致的洗滌可能會(huì)導(dǎo)致整個(gè)板不一致，從而導(dǎo)致結(jié)果不可靠。
在用蛋白質(zhì)或抗體包被ELISA板后，通常需要封閉以防止以下方案步驟中檢測(cè)抗體的任何非特異性結(jié)合。將與測(cè)定無(wú)關(guān)的混合蛋白加入板中并在板中孵育，占據(jù)任何可用的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。常見(jiàn)的蛋白質(zhì)封閉緩沖液選擇包括脫脂奶粉、牛血清白蛋白（BSA）和酪蛋白等?；蛘?，非離子去污劑，如Tween-20或Triton X-100，可用作封閉劑，但不能像蛋白質(zhì)那樣提供永久封閉。無(wú)效的板封閉會(huì)導(dǎo)致背景噪音增加并降低檢測(cè)的靈敏度和特異性。
封閉過(guò)程如何防止非特異性結(jié)合
抗體
抗體是大多數(shù)ELISA的基石，選擇合適的抗體至關(guān)重要，尤其是在使用多種抗體的情況下。單克隆抗體和多克隆抗體都可以使用，每種抗體都有自己的優(yōu)點(diǎn)和局限性。單克隆抗體具有高度特異性，但成本更高。另一方面，多克隆抗體可以在多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合靶標(biāo)，從而放大信號(hào)并提高靈敏度。
使用采用二抗的方法會(huì)增加額外的步驟，延長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)間，增加出錯(cuò)的機(jī)會(huì)，并且需要更多優(yōu)化才能找到合適的兼容抗體對(duì)。然而，使用多克隆二抗的靈敏度增益可能使這成為開(kāi)發(fā)有效檢測(cè)方法必不可少的。
無(wú)論使用哪種ELISA類型，所有ELISA都以檢測(cè)步驟結(jié)束，通常使用酶介導(dǎo)的可見(jiàn)顏色變化化學(xué)試劑，然后可以使用紫外-可見(jiàn)分光光度法進(jìn)行測(cè)量。將酶偶聯(lián)抗原或抗體應(yīng)用于測(cè)試孔，如果存在靶標(biāo)，它將結(jié)合。當(dāng)酶的適當(dāng)?shù)孜锾砑拥桨逯袝r(shí)，它會(huì)導(dǎo)致與孔內(nèi)結(jié)合的靶標(biāo)量成正比的顏色變化。辣根過(guò)氧化物酶（HRP）是一種常見(jiàn)的偶聯(lián)物，與底物3,3'，5,5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）合作使用，TMB在HRP的作用下變成藍(lán)色，然后在加入硫酸溶液后變成黃色，從而終止反應(yīng)。
然后可以使用酶標(biāo)儀（在添加終止液后檢測(cè)450 nm）確定每個(gè)孔的吸光度值，并根據(jù)分析設(shè)計(jì)進(jìn)行校正和計(jì)算，例如減去平均空白孔值、平均技術(shù)重復(fù)或與標(biāo)準(zhǔn)品的比率計(jì)算。
ELISA 工作流程示例
五、ELISA檢測(cè)結(jié)果分析
ELISA結(jié)果可以定量、定性或半定量。在定量分析中，使用已知標(biāo)準(zhǔn)品的連續(xù)稀釋來(lái)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，通常是光密度（OD）與濃度的關(guān)系曲線。由此，可以計(jì)算出未知樣品中靶標(biāo)的精確數(shù)量。
ELISA實(shí)驗(yàn)中未知物的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算和目標(biāo)濃度測(cè)定示例
在定性分析中，通常仍會(huì)使用酶標(biāo)儀以數(shù)值方式收集數(shù)據(jù)，但與沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)曲線的空白和/或陰性孔進(jìn)行比較，結(jié)果將被解釋為陽(yáng)性或陰性。
半定量分析還可以在不使用連續(xù)稀釋或標(biāo)準(zhǔn)曲線的情況下收集數(shù)值數(shù)據(jù)。然而，同時(shí)包含陰性和陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品（通常為高陽(yáng)性和低陽(yáng)性），有助于對(duì)未知樣品孔與已知狀態(tài)樣品孔之間的水平進(jìn)行相對(duì)比較。使用這些標(biāo)準(zhǔn)品監(jiān)測(cè)檢測(cè)重現(xiàn)性，可以設(shè)置一個(gè)臨界值，其中超過(guò)閾值的結(jié)果被確定為陽(yáng)性，低于臨界值的結(jié)果被確定為陰性。
雖然在某些情況下可能需要定量分析，但在每個(gè)板上包含完整的標(biāo)準(zhǔn)曲線會(huì)占用寶貴的孔。因此，根據(jù)使用者希望從檢測(cè)結(jié)果中獲得的信息，存在方式的權(quán)衡。
與許多檢測(cè)方法一樣，從ELISA獲得的結(jié)果很少可能達(dá)到100%準(zhǔn)確，可能會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果。因此，大多數(shù)測(cè)試將與敏感性和特異性的測(cè)量相關(guān)聯(lián)；它們?cè)浇咏?00%，測(cè)試就越好。
有許多因素會(huì)影響這些值，例如：非特異性結(jié)合或交叉反應(yīng)性從而帶來(lái)的高背景；抗體對(duì)靶標(biāo)的親和力差次；檢測(cè)條件；樣品條件和復(fù)雜性。
因此，計(jì)算靈敏度和特異性值是許多ELISA檢測(cè)開(kāi)發(fā)中的重要步驟，尤其是在診斷環(huán)境中，以確定所獲得結(jié)果的信息量和可靠性。
